Beschreibung
Produkttyp: Unkonjugiert
Lieferzyklus: Spot
Betrag: 3000 mal
Produkteinführung
Dieses Kit zum Nachweis der Lebensfähigkeit von CCK-8-Zellen enthält WST-8 (2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo Benzene)-2H-tetrazol Mononatriumsalz) . In Gegenwart von Elektronenträgern wird WST-8 oxidiert und durch intrazelluläre Dehydrogenase reduziert, um wasserlösliche orange-gelbe Formazanfarbstoffe herzustellen, die in Gewebekulturmedium gelöst werden können. Die Menge an Formazan ist direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen. Die CCK-8-Methode ist eine hochempfindliche, nicht radioaktive kolorimetrische Nachweismethode zur Bestimmung der Anzahl lebender Zellen in Zellproliferations- oder Toxizitätsexperimenten, die die traditionelle MTT-Methode ersetzen kann.
Bringen Sie Ihre eigenen Instrumente und Reagenzien außerhalb des Kits mit
Niedriggeschwindigkeitszentrifuge, Mikroplatten-Reader (450 nm Wellenlänge), Plattenschüttler, Mikropipette, 96-Well-Kulturplatte, CO2-Inkubator
Schritte
- Fügen Sie normalerweise 100 ul (2000 Zellen) pro Loch für Zellproliferationsexperimente hinzu, fügen Sie 100 ul (10000 Zellen) pro Loch für Zytotoxizitätsexperimente hinzu (die spezifische Anzahl der in jedem Loch verwendeten Zellen hängt von der Größe der Zellen und der Geschwindigkeit der Zellproliferation ab.) , etc.) Faktoren bestimmen). Die Kulturplatte in einem Inkubator 24 Stunden vorinkubieren (bei 37 °C, 5 % CO2).
- Je nach Bedarf des Experiments kultivieren und 0-10 ul spezifische Drogenstimulation geben.
- Bewahren Sie die Kulturplatte für einen angemessenen Zeitraum im Brutschrank auf (zB: 24 Stunden oder 48 Stunden).
- 10 ul CCK-8-Lösung in jede Vertiefung geben. Wenn das anfängliche Kulturvolumen 200 μl beträgt, müssen 20 μl CCK-8-Lösung hinzugefügt werden, und der Rest kann analog abgeleitet werden. Die Wells mit entsprechenden Mengen an Zellkulturmedium und CCK-8-Lösung, jedoch ohne Zellen, können als Blindwertkontrolle verwendet werden. Wenn Sie befürchten, dass die verwendeten Medikamente den Test stören, müssen Sie die Wells mit der entsprechenden Menge an Zellkulturmedium, Medikamenten und CCK-8-Lösung, jedoch ohne zugesetzte Zellen, als Blindwertkontrolle besetzen. (Versuchen Sie, keine Blasen im Loch zu erzeugen)
- Inkubieren Sie die Kulturplatte 1-4 Stunden im Brutschrank.
- Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät.
- Wenn Sie den OD-Wert vorübergehend nicht messen möchten und später messen möchten, können Sie 10 μl 0,1 M HCl-Lösung oder 1% (W/V) SDS-Lösung in jede Vertiefung geben und die Kulturplatte abdecken, um dies zu vermeiden anzünden und bei Zimmertemperatur lagern. Die Absorption ändert sich innerhalb von 24 Stunden nicht.
Ergebnisbeurteilung
(1) Zellüberlebensrate: Subtrahieren Sie den Hintergrund-OD-Wert vom OD-Wert jeder Testvertiefung (vollständiges Medium plus CCK-8, keine Zellen) und nehmen Sie den Mittelwert ± SD für den OD-Wert jeder wiederholten Vertiefung.
Die Zellüberlebensrate wird als T/C% ausgedrückt, T ist der OD-Wert der Zellen mit Arzneimittelzusatz und C ist der OD-Wert der Kontrollzellen. Zellüberlebensrate % = (OD von Zellen mit Wirkstoffzusatz/OD von Kontrollzellen) × 100
(2) Finden Sie die Arzneimittelkonzentration bei T/C = 50 % (IC50) oder die Arzneimittelkonzentration bei T/C = 10 % (IC90).
Lagerbedingungen: 4℃ lichtgeschützt, ein Jahr gültig
Vorsichtsmaßnahmen
- Achten Sie darauf, dass die Zellsuspension während der Inokulation gemischt werden muss, um eine Ausfällung von Zellen zu vermeiden, die zu einer ungleichen Anzahl von Zellen in jedem Well führt. Sie können sie jedes Mal mischen, wenn Sie mehrere Wells beimpfen. Das Kulturmedium in einem Lochkreis um die Kulturplatte ist leicht verflüchtigt. Um Fehler zu vermeiden, wird empfohlen, jedem Loch an den vier Seiten der Kulturplatte nur mittleres oder steriles PBS zuzugeben, nicht als Indexerkennungsloch.
- Die beste Reaktionszeit von CCK-8 hängt von der besten Zeit für die spezifische Farbentwicklung ab. Bei der erstmaligen Durchführung des Experiments wird empfohlen, einige Vertiefungen zu machen, um die optimale Anzahl der beimpften Zellen und die optimale Inkubationszeit nach Zugabe von CCK-8-Reagenz herauszufinden. Unter normalen Umständen ist es schwieriger, weiße Blutkörperchen Farbe zu entwickeln, so dass eine längere CCK-8-Reaktionszeit oder eine Erhöhung der Zellzahl (~105 Zellen/Vertiefung) erforderlich sind. Suspensionszellen sind im Vergleich zu adhärenten Zellen schwierig, Farbe zu entwickeln. Suspensionszellen können nach Zugabe von CCK-8 und Inkubation für 1-4 Stunden zuerst aus dem Inkubator genommen werden und der Grad der Färbung kann visuell beobachtet oder mit einem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt werden, um die beste Inkubationszeit für CCK . zu bestimmen -8. Bei schwieriger Farbentwicklung die Kulturplatte wieder in den Brutschrank stellen und vor der Messung einige Stunden weiter inkubieren. Für adhärente Zellen beträgt die Inkubationszeit von CCK-8 im Allgemeinen 1-4 Stunden. Die meisten Zellen können nach 30-minütiger Inkubation visuell beobachtet werden, und der Nachweiseffekt ist am besten, wenn sie etwa 2-4 Stunden lang inkubiert werden.
- Der Nachweis dieses Kits hängt von der durch die Dehydrogenase katalysierten Reaktion ab. Wenn sich mehr Reduktionsmittel im System befinden, die nachgewiesen werden sollen, stören z. B. einige Antioxidantien die Erkennung, versuchen Sie, sie zu entfernen. Das phenolrothaltige Medium hat keinen Einfluss auf die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen in diesem Kit.
- Wie kann festgestellt werden, ob die zu testende Lösung reduzierbar ist? Geben Sie 10 ul CCK-8-Lösung in die Vertiefungen der Testlösung ohne Zellen, inkubieren Sie 1-4 Stunden und messen Sie die Blindabsorption bei 450 nm. Wenn die Extinktion gering ist, bedeutet dies, dass weniger Reduktionsmittel im zu testenden System vorhanden ist und CCK-8 direkt im formalen Test hinzugefügt werden kann; wenn die Extinktion relativ groß ist, bedeutet dies, dass mehr Reduktionsmittel im zu testenden System vorhanden sind und das zu testende System formal getestet wird. In diesem Fall ist es notwendig, das Medium zu entfernen, die Zellen zweimal mit dem Medium zu waschen und dann neues Medium und 10 µl CCK-8 zum Nachweis hinzuzufügen.
- Handelt es sich bei der Probe um eine Zellsuspension mit hoher Trübung, wird empfohlen, 600 nm (oder über 600 nm) als Referenzwellenlänge einzustellen und den O.D-Wert von der Referenzwellenlänge abzuziehen.
- Bitte tragen Sie zur Bedienung Laborkittel und Einmalhandschuhe.
