Beschreibung
Fipronil enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)
Bausatz-Bedienungsanleitung
Dieses Kit ist nur für Forschungszwecke bestimmt.
1 Verwendungszweck:
Dieses Kit dient zum quantitativen Nachweis von Fipronil-Rückständen in Futtermitteln, Fisch, Garnelen und Fleischgeweben (wie Huhn, Rind und Schwein), Eiern, Honig, Milch, Serum und Urin.
2 Versuchsprinzip
Dieses Kit verwendet die kompetitive ELISA-Methode. Die Mikrotiterplatte ist mit Fipronil-gekoppeltem Antigen beschichtet, Fipronil-Standard oder Probe wird hinzugefügt, freies Fipronil ist mit Fipronil-gekoppeltem Antigen auf dem Mikrotiterstreifen vorbeschichtet Konkurrenz mit Anti-Fipronil-Antikörper-Enzymmarkern, Farbe mit TMB-Substrat entwickeln, Farbe ändern von blau bis gelb nach Zugabe der Stopplösung, mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei 450 nm Wellenlänge Extinktion und Fipronil-Gehalt in der Probe erkennen. Umgekehrt proportional wurde der Fipronil-Gehalt in der Probe aus der Standardkurve berechnet.
3 Kit-Zusammensetzung
3.1 Die vorbeschichtete Fipronil-gekoppelte Antigen-ablösbare ELISA-Platte: 1 Stück (12 Wells × 8 Streifen).
3.2 Fipronil-Standard: 6 Flaschen (1 ml/Flasche), Inhalt: 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb.
3.3 Anti-Fipronil-Antikörper-Enzymkonjugat: 1 Flasche (6 ml).
3.4 Farbentwicklerlösung A: 1 Flasche (6 ml).
3.5 Farbentwicklungsflüssigkeit B: 1 Flasche (6 ml).
3.6 Stopplösung: 1 Flasche (6 ml), 2 M Schwefelsäure.
3.7 Probenverdünner: 1 Flasche (10×, 6ml), wird zur Probenverdünnung verwendet.
3.8 Konzentrierte Waschflüssigkeit: 1 Flasche (20×, 20 ml) zum Waschen der Platten.
3.9 Ein Merkblatt.
4 Benötigte, aber nicht bereitgestellte Materialien
4.1 Ausrüstung
4.1.1 Mikroplatten-Reader mit einer Wellenlänge von 450 nm.
4.1.2 Brecher.
4.1.3 Messzylinder.
4.1.4 Oszillator.
4.1.5 Trichter.
4.1.6 Whatman No 1 oder gleichwertiges Filterpapier. 4.1.7 Mikropipette.
4.2 Reagenzien
4.2.1 Entionisiertes Wasser oder destilliertes Wasser.
4.2.2 Methanol.
5 Speicher
5.1 Das Kit wird bei 2~8℃ gelagert, nicht einfrieren
5.2 Unbenutzte Mikrotiterplatten sollten verschlossen und trocken gelagert werden
6 Angelegenheiten, die Aufmerksamkeit erfordern
6.1 Bitte lesen Sie die Anweisungen sorgfältig durch, bevor Sie das Kit verwenden.
6.2 Verwenden Sie keine abgelaufenen Kits.
6.3 Bringen Sie die Reagenzien vor der Verwendung des Kits auf Raumtemperatur (25 ± 2 °C). Es wird empfohlen, für mindestens 2 Stunden auf die Temperatur zurückzukehren.
6.4 Das Standardprodukt enthält Fipronil, daher ist bei der Anwendung besondere Vorsicht geboten und während des Betriebs sollten Handschuhe getragen werden.
6.5 Die Stopplösung enthält Schwefelsäure, die Hautverbrennungen und Korrosion der Kleidung während des Gebrauchs verhindert.
6.6 Spitzen für verschiedene Standards und Proben können nicht gemischt werden, da sonst die Testergebnisse beeinflusst werden.
6.7 Die Reagenzien in den Kits unterschiedlicher Chargennummern dürfen nicht gemischt werden; Die für verschiedene Standards und Proben verwendeten Spitzen dürfen nicht gemischt werden, da dies sonst die Versuchsergebnisse beeinflusst.
6.8 Das Probenverdünnungsmittel in diesem Kit muss zum Verdünnen der Probe verwendet werden, da es sonst die Versuchsergebnisse beeinflusst
6.9 Beim Mischen von Reagenzien sollte Schaumbildung vermieden werden.
7 Arbeitsflüssigkeit vorbereiten
7,1 Fipronil-Standardlösung: 0 ppb, 0,1 ppb, 0,3 ppb, 0,9 ppb, 2,7 ppb, 8,1 ppb
7.2 Konzentrierte Waschflüssigkeit: 1:20 (1+19) mit destilliertem Wasser verdünnen
7.3 Probenverdünner: Zur Verwendung 1:10 (1+9) mit destilliertem Wasser verdünnen
7.3 Chromogener Wirkstoff: zurückhaltend, direktes Licht vermeiden
7.4 Reaktionsstopplösung: gebrauchsfertig
8 Probenverarbeitungsverfahren (Proben sollten während des Extraktionsprozesses streng nach den Anweisungen betrieben werden und der Extraktionsprozess sollte genau verdünnt werden, da sonst die Ergebnisse ungenau werden, die Proben sollten kühl und dunkel gelagert und gekühlt werden)
8.1 Nehmen Sie 10 g zerkleinerte Probe und fügen Sie 20 ml 70%ige Methanollösung hinzu
8.2 3 Minuten kräftig vibrieren
8.3 Filtern mit Whatman No 1 Filterpapier
8.4 Nehmen Sie 25 µl der verarbeiteten Probe und geben Sie 25 µl Probenverdünner in die Reaktionsvertiefung (der Probenverdünnungsfaktor beträgt 2)
9 Schritte des Enzymimmunoassays
9.1 Versuchsanleitung
9.1.1 Bitte bringen Sie alle Reagenzien außerhalb der Box vollständig auf Raumtemperatur (25 ± 2 °C), bevor das Experiment für etwa 2 Stunden beginnt. Nehmen Sie die mikroporösen Streifen nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur (25±2) heraus, verschließen Sie die überschüssigen mikroporösen Streifen wieder und lagern Sie sie sofort bei 2~8℃
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Temperaturrückführung ausreichend ist, da sonst die Genauigkeit und Genauigkeit der Erkennung beeinträchtigt werden.
9.1.2 Bitte stellen Sie das Reagenz sofort nach Gebrauch auf 2~8℃ zur Lagerung zurück
9.1.3 Bitte ändern Sie das Analyseprogramm nicht
9.1.4 Bitte verwenden Sie eine genaue Mikropipette
9.1.5 Nach dem Start des Vorgangs bitte kein Programm unterbrechen
9.1.6 Die Reproduzierbarkeit der ELISA-Ergebnisse hängt stark von den Arbeitsabläufen ab. Bitte halten Sie sich strikt an die Anforderungen
9.1.7 Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollte jeder Standard und jede Probe mit unterschiedlichen Spitzen befüllt werden
9.1.8 Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze beim Hinzufügen von Proben nicht die Lösung oder die Innenfläche der Mikrotiterplatte berührt
9.2 Analyseschritte
9.2.1 Vornummerieren, Pos. markieren
Bei B0, Standards und Proben wird empfohlen, eine Doppellochdetektion durchzuführen
9.2.2 Nehmen Sie die erforderliche Anzahl an Mikroporen (Mikroporenstreifen können entfernt werden), verschließen Sie die überschüssigen Streifen wieder und legen Sie sie sofort bei 2~8℃ zur Lagerung zurück
9.2.3 Probenverdünnungslösung (10x), konzentrierte Waschlösung (20x) werden in Arbeitslösung verdünnt (verdünnt mit destilliertem Wasser oder entionisiertem Wasser)
9.2.4 50µl 0.0ppb Standardlösung in Well B0 . geben
9.2.5 50μl Standardlösung in jede Standardvertiefung geben
9.2.6 In jede Probenvertiefung 50 µl Probenlösung geben
9.2.7 50 µl Anti-Fipronil-Antikörper-Enzym-Konjugat in alle Vertiefungen geben
9.2.8 Schütteln Sie die Reaktionsplatte einige Sekunden lang vorsichtig.
9.337℃ warmes Bad für 30 Minuten (durch gelegentliches Antippen der Reaktionsplatte während des warmen Bades kann der Doppellochfehler reduziert werden)
9.3.1 Flüssigkeit in den Wells abschütteln, Mikrotiterplatte 5 Mal mit Lotion waschen und ein letztes Mal auf saugfähiges Papier klopfen, um die Flüssigkeit in den Wells vollständig zu entfernen.
9.4 Reaktion
9.4.1 Nach Abschluss des Waschvorgangs sofort mit einer Mikropipette 50 µl der chromogenen Lösung A und dann 50 µl der chromogenen Lösung B in jedes Mikrowell geben; Schütteln Sie die Reaktionsplatte leicht, um sie gründlich zu mischen
9.4.237℃ warmes Bad für 10min
9.4.3 50 µl Stopplösung in jedes Well geben und gut mischen
9.4.4 Ermitteln Sie die Extinktion bei 450 nm und lesen Sie das Ergebnis innerhalb von 5 Minuten ab.
10 Ergebnisberechnung
10.1 Quantitative Analyse
10.1.1 Der Durchschnittswert (B) des Extinktionswertes jeder erhaltenen Konzentrationsstandardlösung und Probe wird durch den Extinktionswert (B0) des ersten Standards (0 Standard) dividiert und mit 100 % multipliziert, dem prozentualen Extinktionswert .
B – durchschnittlicher Extinktionswert der Standardlösung oder Probenlösung B0 – durchschnittlicher Extinktionswert der 0 ppb Standardlösung
10.1.2 Verwenden Sie den logarithmischen Wert der Fipronil-Konzentration als X-Achse und den prozentualen Extinktionswert als Y-Achse, um eine Standardkurve zu zeichnen. Entsprechend dem prozentualen Extinktionswert der Probe kann die Abszisse des entsprechenden Punktes aus der Kurve gewonnen werden, die der Logarithmus der Fipronilkonzentration ist, und der Antilog ist die Fipronilkonzentration C (ppb) in der Messlösung in
10.1.3 Da die Probe vorverdünnt wurde, muss die aus der Standardkurve erhaltene Konzentration der Probe mit ihrem Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
10.2 Semiquantitative Bestimmung
10.1.1 Visuelle halbquantitative Bestimmung: Zuerst eine geeignete Standardlösung auswählen und mit der Probe laufen lassen und anhand des Farbvergleichs zwischen Probe und Standard beurteilen, ob der Probenkonzentrationswert kleiner oder größer als der Standardwert ist .
10.1.2 Semiquantitative Messung des Gerätes: Zuerst eine geeignete Standardlösung auswählen und mit der Probe laufen lassen und anhand des Vergleichs der Extinktionswerte beurteilen, ob der Probenkonzentrationswert kleiner oder größer als der Standardwert ist der Probe und des Standards.
11 Spezifität
Substanz Kreuzreaktion Fipronil 100%
12 Kit-Parameter
Die untere Nachweisgrenze dieses Kits beträgt 0,05 ppb. Der beste Absorptionswert von B0 sollte größer als 1,0 . sein
Der Fehler innerhalb der Extinktionsplatte des Kits beträgt weniger als 8 % und der Fehler zwischen den Platten beträgt weniger als 15 %. Die Wiederfindungsrate der in diesem Handbuch beschriebenen Methode zur Entnahme von Gewebeproben beträgt mehr als 80 %. 13
Der vom Kit bereitgestellte Standardkurvenbereich beträgt 0,1 ppb bis 8,1 ppb.
14 Analysebeschränkungen
Die mit diesem Kit positiv getesteten Proben sollten durch eine andere Methode wie HPLC oder GC/MS bestätigt werden.
